氧化锆研磨珠在DNA提取中主要用于高效破碎细胞或组织,其高密度和耐磨性可确保快速、均匀的研磨效果,同时避免污染。以下是关键步骤和注意事项:
1. 样品准备
细菌/细胞处理:离心收集菌体,用PBS洗涤后重悬于裂解缓冲液(含SDS、EDTA等),或冷冻保存于-80°C(RNA提取需防降解)。
组织处理:如植物种子或动物组织需剪碎或直接研磨,坚硬组织建议使用更高密度的氧化锆珠。
2. 研磨参数优化
珠子选择:根据样本类型调整直径(如细菌用0.1-0.5 mm,植物组织用1.0-2.0 mm)。
裂解缓冲液:
DNA提取:含1% SDS、蛋白酶K的Tris-EDTA缓冲液。
RNA提取:需添加β-巯基乙醇和RNase抑制剂。
研磨条件:频率20-30 Hz,间歇研磨(如30秒开/30秒停),全程4°C操作防止核酸降解。
3. 后续纯化
离心去碎片:12,000 ×g离心5分钟,转移上清至新管。
DNA纯化:酚-氯仿抽提或乙醇沉淀,70%乙醇洗涤后溶于TE缓冲液。
RNA纯化:需立即用异丙醇沉淀或硅胶膜离心柱纯化,并DNase处理去除DNA残留。
4. 应用场景
微量检材:如烟蒂、牙刷等,硅珠法(含氧化锆研磨)可获高质量DNA,满足STR分型需求。
植物样本:氧化锆珠结合研磨仪可快速提取玉米、水稻等基因组DNA,效果优于传统CTAB法。
注意事项
温度控制:全程低温操作,避免核酸降解。
珠子灭菌:DNA/RNA提取前需高压灭菌氧化锆珠,RNA提取需DEPC水处理。
抑制物影响:泥土中的二氧化硅可能干扰硅珠法DNA回收,需优化裂解条件。